Strukturelle Charakterisierung eines bodenviralen Hilfsstoffwechselgenprodukts

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5485 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Metagenomik bringt die bisher verborgene Welt der Bodenviren ans Licht. Viele Bodenvirussequenzen in Metagenomen enthalten mutmaßliche Hilfsstoffwechselgene (AMGs), die nicht mit der Virusreplikation assoziiert sind. Hier stellen wir fest, dass AMGs auf Bodenviren tatsächlich funktionelle, aktive Proteine ​​produzieren. Wir konzentrieren uns auf AMGs, die möglicherweise Chitosanase-Enzyme kodieren, die Chitin – ein häufig vorkommendes Kohlenstoffpolymer – metabolisieren. Wir exprimieren und funktionell screenen mehrere Chitosanase-Gene, die aus Umweltmetagenomen identifiziert wurden. Ein exprimiertes Protein mit Endo-Chitosanase-Aktivität (V-Csn) wird kristallisiert und mit ultrahoher Auflösung strukturell charakterisiert und stellt somit die Struktur eines bodenviralen AMG-Produkts dar. Diese Struktur liefert Details über das aktive Zentrum und erleichtert zusammen mit mit AlphaFold ermittelten Strukturmodellen das Verständnis der Substratspezifität und des Enzymmechanismus. Unsere Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Bodenviren ihren Wirten Hilfsfunktionen verleihen.

Jüngste metagenomische Untersuchungen haben eine große Vielfalt an DNA-Viren in einer Reihe von Bodenlebensräumen ergeben, darunter Permafrost1,2, aufgetauter Permafrost3 und Grasland4. Bei den meisten dieser Viren handelt es sich um Bakteriophagen3,4, obwohl auch mehrere eukaryotische Viren nachgewiesen wurden1,2. Eine grundlegende und weitgehend unbeantwortete Frage betrifft die funktionelle Rolle dieser Viren im Bodenlebensraum. Es ist bekannt, dass Bodenbakteriophagen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Wirtsdynamik spielen5. Interessanterweise können Bodenviren auch direkt zu biogeochemischen Prozessen im Boden beitragen, indem sie Gene exprimieren, die möglicherweise Funktionen kodieren, die nicht direkt für die Virusreproduktion erforderlich sind. Gene, die nicht-essentiellen viralen Funktionen entsprechen, werden als Auxiliary Metabolic Genes (AMGs) bezeichnet. Zu den potenziellen Funktionen, die von AMGs kodiert werden, gehören der Kohlenstoffstoffwechsel, die Sporulation und die Energieerzeugung6,7. Bisher wurde jedoch nur ein bodenvirales AMG exprimiert und funktionell charakterisiert3 und es liegen keine Kristallstrukturen für bodenvirale AMG vor.

Die Untersuchung von AMGs in Bodenviren hinkt der Untersuchung von Meeresumgebungen hinterher, da die große Vielfalt und Komplexität der Bodenlebensräume die Entdeckung von Viren erschwert hat. In Meeresökosystemen wurden virale AMGs, die photosynthetische Proteine ​​kodieren, ausführlich untersucht8,9. Beispielsweise wurde gezeigt, dass einige Meeresviren psbA-Gene exprimieren, wobei die Transkripte während der Infektion der Wirte zunahmen10,11. Auf Proteinebene wurde die Struktur eines Plastocyanin-Proteins, das von einem cyanobakteriellen Phagen (Cyanophagen) kodiert wird, basierend auf einer verwandten Referenzstruktur von Synechococcus sp. modelliert. PCC79428. Durch Vergleich mit der ähnlich modellierten Struktur des Wirtsplastocyanins war es möglich, Cyanophagen-spezifische Modifikationen der Struktur und des elektrostatischen Potentials des Cyanophagen-kodierten Plastocyanins vorherzusagen. Darüber hinaus wurde kürzlich die Struktur eines viralen Rhodopsins mit einer Auflösung von 1,4 Å charakterisiert. Die Struktur ergab, dass es sich bei den viralen Rhodopsinen um einzigartige lichtgesteuerte Kanäle handelt, die eine vorhergesagte Rolle bei der Unterstützung der Photosynthese von Algen spielen12. Diese jüngsten Entdeckungen bei Meeresviren unterstreichen die ökologische Bedeutung von AMGs, die möglicherweise die Fitness von Phagen und Wirten in der Umwelt maximieren.

Die ersten AMGs, die in Bodenviren beschrieben wurden, waren Gene, die Enzyme für den Abbau verschiedener organischer Verbindungen kodierten. Beispielsweise wurden 14 Glycosidhydrolase-Gene in Metagenomen aus aufgetautem Permafrost nachgewiesen. Eines davon, ein virales Gen, das für ein Glykosylhydrolase-Enzym der Gruppe 5 (GH5) kodiert, wurde kloniert, exprimiert und es stellte sich heraus, dass es eine funktionelle Endomannanase darstellt3. Der überwiegenden Mehrheit der vorhergesagten bodenviralen AMGs wurden potenzielle Funktionen allein aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeiten mit annotierten Genen in mikrobiellen Genomdatenbanken zugewiesen4,5. Dieser Ansatz ist jedoch nur begrenzt in der Lage festzustellen, ob das AMG tatsächlich exprimiert wird und ob das Protein funktionsfähig ist.

AMGs wurden auf Bodenviren gefunden, die möglicherweise Gene kodieren, die am Abbau von Chitin4,13 beteiligt sind, dem zweithäufigsten Kohlenstoffpolymer auf dem Planeten nach Cellulose14. In offenen Ozeanen nutzen Picocyanobakterien Chitin, das hauptsächlich von Arthropoden produziert wird, als wichtige Nährstoffquelle15. Chitin kann sich auch im Boden anreichern, da es Bestandteil der Zellwände von Pilzen und des Exoskeletts von Insekten ist. Nach der Deacetylierung des Chitin-Polymers zu Chitosan durch Chitin-Deacetylasen spalten Chitosanasen Chitosan in kleinere Untereinheiten, die weiter abgebaut werden können, und stellen so Kohlenstoff- und Stickstoffquellen für andere Mitglieder der Mikrobiota bereit.15 Chitosanase-Gene wurden zuvor im Genom eines Riesenvirus annotiert. Chlorovirus, das grüne Mikroalgen in terrestrischen Gewässern infiziert16 und die nachgewiesenen viralen Chitosanasen wurden als zur Glykosylhydrolase-Gruppe 46 (GH46) gehörend charakterisiert. Chitosanase-ähnliche AMGs, die auf Bodenviren übertragen werden, fallen hauptsächlich in eine andere Gruppe, die zuvor als GH75-Pilz-Chitosanasen (pfam07335) kategorisiert wurde, die Beta-1,4-Chitosane mit endo-spaltender Aktivität spalten.

Hier charakterisieren und validieren wir die Funktion und Struktur eines bodenviralen Chitosanase-AMG-Produkts. Wir bestätigen, dass die Chitosanase tatsächlich funktionsfähig ist, indem wir das Gen klonen und exprimieren und Aktivitätstests durchführen. Wir erhalten eine ultrahochaufgelöste Kristallstruktur des Enzyms, die Details zum potenziell aktiven Zentrum der GH75-Chitosanasenfamilie liefert.

Virale Contigs, die GH75-Chitosanase-AMGs trugen, wurden aus der Datenbank „Integrated Microbial Genomes and Virome (IMG/VR)“ (v3.0) abgerufen. Insgesamt 142 qualifizierte GH75-Chitosanase-ähnliche AMGs wurden aus viralen Contigs mit Längen zwischen 8 und 202 kb identifiziert. Der Großteil der Sequenzen stammte von Bakteriophagen mit nicht klassifizierter Taxonomie. Zwei der viralen Contigs waren hochwertige vollständige und zirkularisierte Genome (Ergänzungstabelle 1).

Aus den Sequenzdaten wurde ein Proteinbaum erstellt, um die Verwandtschaft viraler Chitosanasen mit anderen in öffentlichen Datenbanken hinterlegten mikrobiellen Chitosanasen darzustellen. Die viralen Chitosanasen unterschieden sich phylogenetisch von archaealen, pilzlichen und bakteriellen GH75-Chitosanasen (Abb. 1). Die GH75-Chitosanasen gruppierten sich hauptsächlich entsprechend ihrer taxonomischen Zuordnung in separate Kladen, mit Ausnahme der archaealen Chitosanasen, was auf einen Mangel an archaealen Vertretern in der aktuellen NCBI-Datenbank zurückzuführen sein könnte. Der Großteil der nachgewiesenen viralen Chitosanasen bildete enge Kladen, die mit bakteriellen Chitosanasen verwandt waren (Abb. 1). Die phylogenetische Platzierung der viralen Chitosanasen lässt darauf schließen, dass sie durch Genomaustausch aus Bakterien entstanden und während genetischer Drift- und Diversifizierungsprozesse in virusspezifische Versionen umgewandelt wurden17. Diese Hypothese wird weiter durch die Feststellung gestützt, dass die viralen Contigs, die GH75-Chitosanasen enthielten, als Bakteriophagen klassifiziert wurden (Ergänzungstabelle 1).

a Der phylogenetische Baum mit viralen, pilzlichen (grün), bakteriellen (rosa) und archaealen (schwarz) Chitosanasen wird von einem Bakteriophagen-Lysozym (YP_006987285.1, roter Knoten) verwurzelt. Die Blätter der Bäume, die virale Chitosanasen darstellen, sind je nach Lebensraum gefärbt: aquatisch (blau), künstlich angelegt (orange), terrestrisch (braun). Die vier Schlüsselreste im vorgeschlagenen aktiven Zentrum sind farblich gekennzeichnet und in den kreisförmigen Ringen der Reihe nach dargestellt, wobei der Rest am nächsten zur N-terminalen Position im innersten Ring liegt. Die für die Validierung der enzymatischen Funktion ausgewählten viralen Chitosanasen sind mit Sternchen hervorgehoben. Die zur Kristallisation verwendete virale Chitosanase ist mit zwei Sternchen gekennzeichnet. b Die relativen Häufigkeiten jedes Rests an den vier konservierten Stellen wurden berechnet und in der Tabelle aufgeführt. c Die Proteinstrukturen repräsentativer Chitosanasen wurden von AlphaFold20 vorhergesagt und sind nach phylogenetischen Gruppen gefärbt: Bakterien (rosa), Pilze (grün), Viren (braun).

Ein Mehrfachsequenz-Alignment wurde erstellt, um zu bestimmen, ob die viralen Chitosanasen vier konservierte Reste enthielten, die sich in einem vermutlich aktiven Zentrum für bakterielle und pilzliche GH75-Chitosanase-Sequenzen befanden18,19 (Ergänzende Daten 1). Die viralen GH75-Chitosanasen behalten im Allgemeinen die gleichen vier Schlüsselreste für die vorhergesagten aktiven Zentren, DDDE, bei, obwohl einige der Sequenzen Substitutionen aufwiesen. Die meisten GH75-Chitosanasen haben Aspartat an der ersten der vier Positionen, mit einigen wenigen Substitutionen von Cystein oder Asparagin (innerster Ring in Abb. 1). Da Substitutionen in den Schlüsselresten die vorhergesagte Funktion beeinflussen können, haben wir diese viralen Chitosanasen weiter in Untergruppen unterteilt, da es den Anschein hat, dass die Häufigkeit der oben beschriebenen Varianten von Resten im aktiven Zentrum dazu neigt, sich zu häufen. Die identifizierten viralen Chitosanasen wurden in drei Hauptklassen eingeteilt („Klade 1“, „Klade 2“ und „Klade 3“ in Abb. 1). Die Substitutionen von Cystein (relative Häufigkeit 14,79 %, Abb. 1) und Asparagin (relative Häufigkeit 7,75 %, Abb. 1) an der ersten Position („D34“) wurden nur bei viralen Chitosanasen der Klassen 1 und 3 beobachtet. Virus-Chitosanasen der Klade 2 und Gruppe 2 enthielten die gleichen Rückstände wie die meisten bakteriellen und pilzlichen Chitosanasen. Virale Chitosanasen in Klasse 1 mit und ohne Cystein-Substitutionen wurden als Gruppe 1.1 bzw. Gruppe 1.2 bezeichnet, und diejenigen in Klasse 3 mit und ohne Asparagin-Substitutionen wurden als Gruppe 3.1 bzw. Gruppe 3.2 bezeichnet. Einige der viralen Chitosanasen werden nach Probenherkunft gruppiert, wobei Bodenviren getrennt von Wasserviren gruppiert werden. Die bodenspezifischen Sequenzen befanden sich hauptsächlich in Gruppe 1.2 und Klade 3.

Vertreter der verschiedenen Clades (Abb. 1) wurden für die Strukturvorhersage mithilfe der kürzlich eingeführten, auf künstlicher Intelligenz basierenden Proteinstrukturvorhersagesoftware AlphaFold20 ausgewählt. Die Strukturen mehrerer bakterieller und pilzlicher GH75-Chitosanasen, die zuvor in der Literatur beschrieben und charakterisiert wurden, wurden ebenfalls vorhergesagt. Zwei charakteristische Sequenzbereiche, die allen GH75-Mitgliedern gemeinsam sind, bildeten eine Glykosylhydrolase-Domänenfaltung, die in anderen Familien, beispielsweise GH45, zu sehen ist. Diese gemeinsam genutzten Regionen umfassen eine nicht charakterisierte Domäne, eine variable Region, die unterschiedliche Einfügungen unterschiedlicher Länge enthält (ergänzende Abbildung 1). In mehreren vorhergesagten Strukturen viraler AMG-Produkte faltet sich diese Insertion als eine nicht charakterisierte Domäne von etwa 70 Aminosäuren, die eine Seite eines markanten Spalts in der Mitte der gesamten Struktur bildet. Einige bakterielle Mitglieder von GH75 scheinen eine homologe Insertion zu enthalten (ergänzende Abbildung 1). Anderen viralen Chitosanase-ähnlichen AMG-Sequenzen und allen vorhergesagten Bakterien- und Pilzsequenzen fehlt diese längere Insertion und sie scheinen keine wesentliche Domäne zu bilden. Sofern diese Sequenzen nicht homologe Sequenzbereiche aufweisen, können diese Strukturvorhersagen bei der vergleichenden Analyse der verschiedenen Gruppen hilfreich sein.

Die DNA-Kodierungssequenzen für 10 der 142 GH75-Chitosanase-ähnlichen AMGs wurden für die rekombinante Expression in Escherichia coli codonoptimiert (ausgewählte Sequenzen sind in Abb. 1 mit Sternchen gekennzeichnet). Die Expression wurde für neun der zehn Proteine ​​beobachtet, Protein wurde jedoch hauptsächlich in den unlöslichen Fraktionen in allen bis auf zwei der ursprünglichen Ziele beobachtet. Für die beiden anderen Ziele wurde genügend Protein exprimiert und gereinigt, um die Endo-Chitosanase-Aktivität zu testen. Nur ein exprimiertes Protein, im Folgenden V-Csn (für virale Chitosanase) genannt, zeigte Aktivität und diese Aktivität war nahe pH 5 am höchsten (Abb. 2a). Die entsprechende Sequenz stammt aus Gruppe 3.1 und ist in Abb. 1 mit zwei Sternchen mit den vorhergesagten Resten des aktiven DDDE-Zentrums gekennzeichnet. Diese spezifische Sequenz stammt aus einem Waldbodenmetagenom (Ergänzungstabelle 1). Es wurde vorhergesagt, dass es sich bei dem Virus, das V-Csn trug, um einen Proteobacteria-Phagen handelte (Ergänzungstabelle 1). Die Endo-Chitosanase-Aktivität für V-Csn wurde durch zwei Einzelrestsubstitutionen an Positionen, von denen angenommen wird, dass sie Teil des aktiven Zentrums der Chitosanase sind, weiter bestätigt. Basierend auf biochemischen, kinetischen und Mutationsstudien an den pilzlichen GH75-Chitosanasen von Aspergillus fumigatus21 und Fusarium solani19 wurde zuvor postuliert, dass zwei Reste (D160 und E169 in A. fumigatus und D175 und E188 in F. solani) essentielle katalytische Wirkung haben Rückstände. Die Sequenzanalyse einer bakteriellen GH75-Chitosanase aus Streptomyces avermitilis zeigte, dass diese Reste auch in diesem Enzym konserviert waren18. Basierend auf einem teilweisen Alignment der V-Csn-, A. fumigatus-, F. solani- und S. avermitilis-Sequenzen (Abb. 2b) sind die entsprechenden Reste in V-Csn D148 und E157. Es wurden zwei V-Csn-Konstrukte erzeugt, die entweder eine D148N-Substitution oder eine E157Q-Substitution enthielten, und die Aktivitäten der jeweiligen mutierten Enzyme gemessen. Die Aktivität war für D148N um das Fünffache reduziert und für E157Q nahezu eliminiert (Abb. 2c). Beide Konstrukte eluierten mit Gelfiltrationschromatographie-Retentionszeiten, die mit denen von nativem V-Csn identisch waren, und Zirkulardichroismus-Spektren zeigten, dass beide Konstrukte gefaltet waren. Anschließend wurden Kristallisationsversuche mit V-Csn und den beiden mutierten Enzymen durchgeführt.

a Die Aktivität von V-Csn wurde durch Überwachung der Azurinabsorption bei 590 nm nach seiner Freisetzung als lösliche Azurinzuckerfragmente aus einem unlöslichen, mit Azurin vernetzten Chitosansubstrat (AZCL-Chitosan) getestet. Die Reaktionen wurden bei Raumtemperatur über einen Bereich von pH-Werten in Acetatpuffer durchgeführt. Die Daten stellen den Mittelwert von Wiederholungsexperimenten (n = 3) dar, wobei die Standardabweichung durch die Fehlerbalken angegeben wird. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. b Teilsequenz-Alignment von V-Csn mit drei Chitosanase-Enzymen aus Aspergillus fumigatus, Fusarium solani und Streptomyces avermitilis. Die Sekundärstruktur für V-Csn ist oberhalb der Ausrichtung angegeben. Vier konservierte saure Reste, die möglicherweise an der Katalyse beteiligt sind, sind blau und rot gefärbt. Die Angleichung verfügbarer Sequenzen von Enzymen der GH75-Familie zeigt, dass nur sechs Positionen allgemein konserviert sind, diese vier Säurereste und zwei Glycinreste, wie durch die Sternchen unter der Angleichung angezeigt. c Freisetzung von Azurin durch Wildtyp-V-Csn und zwei Konstrukte, die entweder eine D148N- oder E157Q-Substitution enthalten, in Acetatpuffer bei pH 5,1. Die Daten stellen den Mittelwert von Wiederholungsexperimenten (n = 3) dar, wobei die Standardabweichung durch die Fehlerbalken angegeben wird. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. d Banddarstellung der Apo1-Form des V-Csn-Enzyms mit den beiden hellgrün (Domäne-1) und rosa (Domäne-2) gefärbten Strukturdomänen. Die Nomenklatur der Sekundärstruktur wird zusammen mit den Positionen der N- und C-Termini angegeben. e Überlagerung eines Dimers aus V-Csn apo1 (Molekül 1, gelbes Band) und einem kristallographischen Symmetriepartner (Molekül 2, blaues Band) und dem V-Csn apo2-Homodimer (graue Bänder). Die Sekundärstrukturelemente, aus denen die Dimerschnittstelle besteht, sind angegeben. Mit einem Strich markierte Sekundärstrukturelemente repräsentieren das symmetriebezogene Apo1-Molekül. f Das V-Csn-apo2-Dimer zeigt Molekül 1 als gelbe Moleküloberfläche und Molekül 2 als blaues Band. Die Kontaktfläche zwischen den beiden Molekülen ist auf der gelben Oberfläche von Molekül 1 hellblau dargestellt. Quelldaten sind als Quelldatendatei verfügbar.

Die V-Csn-Struktur wurde in zwei Kristallformen gelöst; apo1 enthält ein einzelnes Molekül in der asymmetrischen Einheit und apo2 enthält ein Dimer in der asymmetrischen Einheit. Die Apo1-Struktur wurde durch Methoden der einfachen anomalen Beugung (SAD) unter Verwendung des Signals von Bromidionen gelöst, die in Kristalle der Apo1-Form eingedrungen waren. Die Struktur wurde automatisch mit phenix.autobuild22 erstellt und mit COOT (v0.9.8.2)23 vervollständigt. Das anomale Bromidsignal erreichte eine Auflösung von etwa 1,5 Å und die Struktur wurde zunächst anhand dieser Daten verfeinert. Die Verfeinerung wurde mit phenix.refine24 anhand eines hochauflösenden apo1-Datensatzes mit einer Auflösung von 0,89 Å abgeschlossen. Das endgültige Modell umfasste 1811 Proteinatome in einer einzelnen Kette, 398 Wassermoleküle, drei Glycerin und ein Sulfatanion. Die endgültigen Werte Rwork und Rfree betrugen 0,1198 und 0,1307 für 174.427 Gesamtreflexionen. Die Apo2-Kristallform wurde durch molekularen Ersatz unter Verwendung der verfeinerten Apo1-Struktur als Suchmodell gelöst und mit phenix.refine verfeinert.

Ein einzelnes V-Csn-Molekül befand sich in der asymmetrischen Einheit apo1. Die Struktur bestand aus zwei nicht zusammenhängenden Strukturdomänen (Abb. 2d). Der N-terminale Teil von Domäne-1 (Reste 1–36) wird zuerst gefaltet und das Polypeptid faltet dann die gesamte Domäne-2 (Reste 37–108), bevor es zur vollständigen Domäne-1 (Reste 109–224) zurückkreuzt. Während der frühen Phasen der Verfeinerung wurde eine Restdichte am N-Terminus beobachtet, die mindestens drei zusätzlichen Resten entsprach. Die Untersuchung der Sequenz des Expressionsvektors ließ darauf schließen, dass drei Reste (G, H und S) des Linkers an das N-terminale Methionin gebunden waren und diese Reste dem Modell hinzugefügt wurden. Die apo2-Struktur besteht aus zwei unabhängigen V-Csn-Molekülen in der asymmetrischen Einheit und die beiden Moleküle bilden ein nichtkristallographisches Dimer (Abb. 2e). Die Überlagerung der beiden Moleküle des Apo2-Dimers mit der Apo1-Struktur ergibt eine quadratische mittlere Abweichung (RMSD) von 0,45 Å für beide Moleküle. In der Apo1-Kristallform wird das gleiche Dimer beobachtet, obwohl es durch die kristallographische Symmetrie der C2-Raumgruppe erzeugt wird (Abb. 2e). Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass V-Csn aufgrund der Größenausschlusschromatographie als Dimer in Lösung vorliegt, obwohl es keinen Hinweis darauf gibt, dass eine Dimerisierung für die Enzymaktivität erforderlich ist. Die Bildung des Dimers vergräbt 1830 Å2 (∼9 %) der Oberfläche pro Monomer. Die Kontaktbereiche umfassen die Schleife zwischen den β-Strängen β4 und β5 (in Domäne-2) in einem Molekül, die zwischen den Helices α3 und α4 im zweiten Molekül verläuft (Abb. 2f), verbunden über Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen mit Resten aus dem zwei Helices und Strang β8.

Domäne-1 besteht aus einem zentralen sechssträngigen antiparallelen verdrillten β-Faltblatt, das aus den Strängen β1, β2, β3, β7, β8 und β10 besteht (Abb. 3a, b). Zwei kurze Stränge (β6 und β9) liegen an der konkaven Seite des zentralen β-Faltblatts an, und zwei Helices (α4 und α5) wickeln sich über die konvexe Seite des Blatts. Eine Dali-Suche25 unter Verwendung der isolierten Domäne-1 ergibt über 1000 Treffer mit einem Z-Score größer als 5. Eine erste Analyse der Top-Treffer zeigt, dass Domäne-1 strukturelle Ähnlichkeit mit einer Vielzahl von Proteinen aufweist, die alle eine gemeinsame Kerndomäne haben bestehend aus einem Doppel-psi-β-Fass (DPBB), das aus den Strängen β3, β6, β7, β8, β9 und β10 besteht. Zu diesen Proteinen gehören die pflanzlichen Abwehrproteine ​​Kiwellin26,27, Barwin28 und Carwin29, das Pilz-Phytotoxin Cerato-Platanin30, der Streptomyces-Papain-Inhibitor (SPI)31, die Domäne 1 der Expansine (Proteine, die pflanzliche Zellwände lockern)32,33, der Mensch Ubiquitin-regulatorische Domäne von ASPL34 und die Kohlenhydrat-hydrolysierenden Endoglucanasen35,36,37. Barwin, Carwin und die Endoglucanasen werden als Mitglieder der Glycosylhydrolase-GH45-Familie klassifiziert (https://pfam.xfam.org/family/PF02015), und der Vergleich mit V-Csn zeigt, dass sowohl die GH45- als auch die GH75-Enzyme einen starken Einfluss haben strukturelle Ähnlichkeit. Beide Familien haben jedoch keine strukturelle Ähnlichkeit mit den GH46-Enzymen, von denen die meisten als Chitosanasen bezeichnet werden, die jedoch eine α-helikale Zweidomänenarchitektur aufweisen, die an T4-Lysozym erinnert38.

eine Domäne-1 der Apo1-Struktur, die so ausgerichtet ist, dass sie auf das Strukturmotiv des Double-psi-β-Barrel (DPBB) blickt. Die Stränge, aus denen das DPBB besteht, sind hellgrün hervorgehoben. b Topologiediagramm von Domäne-1, das die Falte des DPBB-Motivs hervorhebt (hellgrün). c Die beiden Psi-Motive (grün und cyan) aus der V-Csn-apo1-Struktur, dargestellt in ungefähr derselben Ausrichtung, sodass ihre strukturelle Ähnlichkeit offensichtlich ist. d Die beiden psi-Motive im Kontext der V-Csn-apo1-Struktur. Das grüne Psi-Motiv hat ungefähr die gleiche Ausrichtung wie in c und das cyanfarbene Psi-Motiv ist um etwa 180° um eine Achse in die Seite hinein gedreht. Zusammen bilden sie das Strukturmotiv des Double-psi-β-Barrel (DPBB). e Überlagerung von V-Csn-Domäne-1 (hellgrün) und Kiwellin aus Actinidia chinensis (PDB-Code 4PMK; orangefarbenes Band). Loop1 und Loop2 in Kiwellin stimmen ungefähr mit Teilen von Domäne-2 (Pink Ribbon) von V-Csn überein. f Überlagerung von V-Csn Domain-1 (hellgrün) und Endoglucanase V aus Humicola insolens (PDB-Code 4ENG; gelbes Band). Die Schleifen 1 und 2 in Endoglucanase V entsprechen ungefähr der Domäne 2 (Pink Ribbon) von V-Csn. g Überlagerung von V-Csn-Domäne-1 (hellgrün) und Expansin aus Clavibacter michiganensis (PDB-Code 4JCW; hellviolettes Band). Loop1 des Expansins entspricht einem Teil der V-Csn-Domäne-2 (Pink Ribbon), die C-terminale Domäne des Expansins (C-Domäne) weist jedoch keine strukturelle Ähnlichkeit mit V-Csn auf.

Die DPBB-Domäne, die zwei ineinandergreifende Psi-Motive umfasst, wurde erstmals für Aspartat-α-Decarboxylase, Endoglucanase V, DMSO-Reduktase und Barwin beschrieben39. In V-Csn besteht jedes Psi-Motiv aus zwei langen antiparallelen Strängen, von denen einer um fast 90° gebogen ist, sodass die N-terminale Hälfte nahezu orthogonal zur C-terminalen Hälfte verläuft, und ein einzelner kurzer Strang parallel zum C-Terminus verläuft Teil des langen Strangs (Abb. 3c). Die beiden Psi-Motive (psi1; β3, β9 und β10 und psi2; β6, β7 und β8) sind relativ zueinander so ausgerichtet, dass die beiden kurzen Stränge (β6 und β9) ein antiparalleles Paar mit einer pseudozweizähligen Achse bilden zwischen ihnen wird psi1 auf psi2 abgebildet (Abb. 3d). Die Überlagerung mehrerer der besten DPBB-haltigen Treffer von Dali zeigt die konservierte Topologie der beiden Psi-Motive in diesen nicht verwandten Proteinen (Abb. 3e – g). Mehrere Schleifenverlängerungen schmücken die DPBB-Domänen dieser Proteine. In Bezug auf die V-Csn-Strangnummerierung sind dies: (i) Loop1, zwischen Strang β3 des psi1-Motivs und dem Strang β6 des psi2-Motivs, (ii) Loop2 zwischen β8 von psi2 und β9 von psi1 und (iii) Loop3 zwischen den Strängen β6 und β10 des psi1-Motivs. In V-Csn kapselt die Loop1-Erweiterung die gesamte Domäne-2 ein, und in anderen Proteinen variiert diese Schleife in Länge und Struktur (Abb. 3e – g).

Die V-Csn-Domäne-2 ist insofern sehr ungewöhnlich, als sie einen deutlichen Mangel an Sekundärstruktur aufweist und auf den ersten Blick im Wesentlichen unstrukturiert zu sein scheint (Abb. 2d). Eine Ramachandran-Plot-Analyse der Phi/Psi-Winkel der Domäne-2 (Abb. 4a) zeigt eine Häufung der Torsionswinkel der Hauptkette in den bevorzugten α- und β-Regionen, wie es für ein gut gefaltetes Protein zu erwarten wäre. Im Gegensatz zu einer typischen Proteinstruktur scheinen der Domäne 2 jedoch lange, kontinuierliche Abschnitte einer α-Helix- oder β-Strang-Struktur zu fehlen. Die Berechnung der Sekundärstruktureigenschaften unter Verwendung mehrerer Algorithmen, einschließlich DSSP (wie in PROCHECK und PyMOL implementiert) und des STRIDE-Servers40, identifiziert alle zwei Single-Turn-310-Helices (α1 und α2) und zwei kurze Stränge (β4 und β5) sowie vier einzelne Reste als β-Brücken bezeichnet (Reste G56, W63, V68 und P74). Die beiden kurzen β-Stränge verlaufen antiparallel zueinander und sind über drei Wasserstoffbrücken verbunden (Abb. 4b). Die vier β-Brückenreste sind in einem Stück Polypeptid zwischen Helix α1 und Strang β4 lokalisiert, das in zwei Haarnadelwindungen gefaltet ist und durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Hauptkettenatomen dieser β-Brückenreste zusammen mit mehreren Seitenketten-/ Wasserstoffbrückenbindungen in der Hauptkette. (Abb. 4c). Eine AlphaFold-Vorhersage von V-Csn, die nach Fertigstellung der Kristallstruktur erstellt wurde, lag über die gesamte Sequenz hinweg bemerkenswert nahe (0,6 Å RMSD für 222 übereinstimmende Cα-Atome), einschließlich der nicht charakterisierten Domäne 2 (0,8 Å RMSD für 67 übereinstimmende Cα-Atome). ) (Abb. 4d).

ein Ramachandran-Diagramm für Domäne-2 von V-Csn apo1. Die Torsionswinkel der Hauptkette (Phi und Psi) werden als hellblaue Dreiecke (Glycin), hellblaue Quadrate (Prolin) und blaue Kreise (alle anderen Reste) angezeigt. Die drei bevorzugten Regionen für β-Faltblätter, α-Helices und linkshändige Helices sind rosa gefärbt. Die zusätzlich erlaubten Bereiche sind hellgelb eingefärbt. b Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden kurzen β-Strängen β4 und β5 in Domäne-2. c Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen in der 20-Reste-Region in Domäne-2 zwischen Helix α1 (einer 310-Helix) und Strang β5 (nur für Hauptkettenatome als graue Stäbchen dargestellt). Diese Region enthält vier Reste, die als β-Brücken bezeichnet werden: G56, W63, V68 und P74 (magentafarben). Diese Reste sind an Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Hauptkette und Hauptkette mit anderen β-Brückenresten und ihnen benachbarten Resten beteiligt. Die Region mit 20 Resten ist in zwei Haarnadelschleifen gefaltet, wobei ein saurer Rest (D57 und D69) in jeder Schleife jede Haarnadel durch Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen mit Amidstickstoffatomen der Hauptkette stabilisiert. d Überlagerung der vorhergesagten AlphaFold-V-Csn-Struktur (graues Band) und der V-Csn-apo1-Kristallstruktur (grüne und rosa Bänder, die Domäne-1 bzw. Domäne-2 darstellen).

Die Untersuchung der Apo1-Struktur zeigt, dass sich die beiden Reste, die als mutmaßliche Reste des aktiven Zentrums identifiziert wurden (D148 und E157), in einer Spalte zwischen den beiden Strukturdomänen befinden (Abb. 5a). In dieser Spalte neben D148 befinden sich auch zwei zusätzliche saure Reste (D34 und D36), und diese Reste waren auch in den anderen GH75-Chitosanasen konserviert (Abb. 2b). In V-Csn geht die Seitenkette von D148 Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Amidstickstoff der Hauptkette von A92 und den Seitenketten von D34 und D36 ein (Abb. 5b). Obwohl die Anhäufung saurer Reste wie diese ungewöhnlich ist, ist sie nicht beispiellos und kommt entweder in Metalloproteinen vor, wo saure Seitenketten durch ihre Rolle bei der Metallbindung eng zusammengebracht werden, oder in aktiven Zentren von Enzymen, wo sie Protonen teilen41. Beim pH-Wert der Kristallisation (4,6) wäre zu erwarten, dass die meisten dieser sauren Reste protoniert und somit im Wesentlichen neutral wären, und die Berechnung der elektrostatischen Oberfläche innerhalb der Spalte des aktiven Zentrums bei diesem pH-Wert zeigt eine sehr geringe negative Ladung (Abb. 5c). ). Beim pH-Optimum des Enzyms (5,1–5,5) wären die Aspartatreste jedoch etwas weniger protoniert und es liegt eine erhebliche negative Ladung im Spalt vor (Abb. 5d), die wichtig sein könnte, um das Chitosansubstrat in die Tasche zu locken .

eine durch Lösungsmittel zugängliche Oberflächendarstellung der V-Csn-apo1-Struktur mit vier konservierten sauren Resten (gelbe und rote Stäbchen), die sich innerhalb der Spalte zwischen den Domänen gruppieren. Oberflächenfarbe wie in Abb. 2d: Domäne-1, grün; Domäne-2, rosa. b Nahaufnahme des mutmaßlichen aktiven Zentrums mit Hervorhebung der vier konservierten sauren Reste. Wasserstoffbrückenbindungen werden als gestrichelte schwarze Linien und Wassermoleküle als rote Kugeln dargestellt. c Elektrostatische Oberfläche von V-Csn apo1, berechnet bei pH 4,6. Die Oberfläche ist von −5 kT/e (rot) bis +5 kT/e (blau) konturiert. d Elektrostatische Oberfläche von V-Csn apo1 berechnet bei pH 5,5. Die Oberfläche ist von −5 kT/e (rot) bis +5 kT/e (blau) konturiert. e Darstellung der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche des Chitohexaose-V-Csn-Komplexes, die die Position der Trisaccharideinheit (gelbe, blaue und rote CPK-Kugeln) im Spalt des aktiven Zentrums zeigt. Die Ausrichtung des Moleküls in der Draufsicht ist ungefähr die gleiche wie in a, und die Unteransicht ist um 90° gedreht, um eine Seitenansicht zu zeigen. Durch Strukturdomänen gefärbtes Enzym (Domäne-1, grün; Domäne-2, rosa). f Restliche Fo-Fc-Elektronendichte (rosafarbenes Netz) für gebundenes Substrat mit einer Kontur von 2,5 σ. Die Elektronendichtekarte wurde nach dem Molekülaustausch und vor dem Einbau des Substrats berechnet. Das endgültige raffinierte Trisaccharidmolekül (GlcN-1, GlcN-2 und GlcN-3) wird als cyanfarbene Stäbchen dargestellt. g Banddarstellung des Chitohexaose-V-Csn-Komplexes mit im aktiven Zentrum gebundenem Trisaccharid (Cyan-Stäbchen). Wasserstoffbrückenbindungen werden durch gestrichelte schwarze Linien und Wassermoleküle als kleine rote Kugeln angezeigt (Domäne-1, grün; Domäne-2, rosa). h Darstellung der lösungsmittelzugänglichen Oberfläche des Cellohexaose-Komplexes der Humicola isolens-Endoglucanase V (Cel45): DPBB-Domäne, gelb; zwei Schleifen für kleine Subdomänen, braun (unten) und orange (oben). Das Cellohexaose-Molekül (Magenta) ist in einem engen Tunnel zwischen der DPBB-Domäne und den beiden Schleifen gebunden. Die Ansicht auf der rechten Seite des Panels ist um 90° gedreht, um das tunnelartige aktive Zentrum im Gegensatz zum offenen aktiven Zentrum in V-Csn zu zeigen. i Lösungsmittelzugängliche Oberflächendarstellung der Endoglucanase von Cryptopygus antarcticus CaCel: DPBB-Domäne, hellblau; Zwei Schleifen sind blau (unten) und cyan (oben) gefärbt. Lage der Substratbindungsspalte und des Tunnels, angezeigt durch das Cellohexaose-Molekül (magentafarbene Stäbchen), abgeleitet vom Cel45-Komplex in h.

Es wurden ortsspezifische Mutanten D148 und E157 konstruiert. In beiden Fällen wurde das Carboxylat in das entsprechende Amid umgewandelt, wodurch die mutierten Proteine ​​D148N und E157Q entstanden. Die beiden mutierten V-Csn-Proteine ​​wurden unter den gleichen Bedingungen wie das Wildtyp-Protein kristallisiert und ihre Strukturen durch molekularen Austausch mit hoher Auflösung bestimmt. Die Überlagerung der beiden Mutantenstrukturen mit der Wildtyp-apo1-Struktur ergab RMSDs von 0,11 bzw. 0,07 Å für alle Cα-Positionen, was auf sehr geringe Konformationsunterschiede zwischen den Mutanten- und Wildtyp-Strukturen schließen lässt. Die Co-Kristallisation beider mutierter Proteine ​​mit Chitohexaose (einem β-(1-4)-verknüpften Polymer aus sechs D-Glucosamin (GlcN)-Resten) ergab nur einen Komplex mit der E157Q-Mutante. Das Substrat befand sich in der Interdomänenspalte (Abb. 5e), wobei drei der sechs GlcN-Reste (im Folgenden als GlcN-1, GlcN-2 und GlcN-3 bezeichnet) in der Fo-Fc-Elektronendichte sichtbar waren (Abb. 5f) und orientiert waren so dass GlcN-1 das reduzierende Ende ist. Die GlcN-2- und GlcN-3-Reste liegen in einer Standard-Sesselkonformation vor, die Dichte für den ersten beobachteten Rest (GlcN-1) deutete jedoch auf eine verzerrte Bootskonformation hin.

Der GlcN-1-Rest ist durch eine einzelne Wasserstoffbrücke zwischen dem O6-Atom und der Seitenkette von Q157 verankert (Abb. 5f). Der zentrale GlcN-Rest (GlcN-2) geht über sein freies Amin Wasserstoffbrückenbindungen mit den Seitenketten von D148 und D36 ein, zusammen mit einem dritten zum Rückgrat-Carbonylsauerstoff von A90 aus Domäne-2. Der GlcN-3-Rest geht über das O6-Atom eine Wasserstoffbrückenbindung mit dem Carbonylsauerstoff von T91 und eine weitere mit einem Wassermolekül ein. Obwohl am nichtreduzierenden Ende von GlcN-3 (dem O4-Atom) eine gewisse zusätzliche Fo-Fc-Dichte beobachtet wurde, ließ die geringe Dichte die Modellierung eines vierten GlcN nicht zu. Die Lage des Trisaccharidfragments und die Wechselwirkungen, die es mit dem Protein eingeht, legen nahe, dass die Reste D36 und D148 die −2-Unterstelle42 bilden und eine Schlüsselrolle bei der Bindung und Ausrichtung des Substrats spielen (in diesem Fall über den GlcN-2-Rest). Der E157-Rest stellt die −1-Unterstelle dar und könnte als nukleophile Gruppe dienen, die für die Bindungsspaltung verantwortlich ist, vorausgesetzt, dass die Hydrolyse am reduzierenden Ende von GlcN-1 stattgefunden hat.

Obwohl die Funktion der V-Csn-Domäne-2 nicht vollständig geklärt ist, deuten mehrere Hinweise darauf hin, dass sie an der Bildung des aktiven Zentrums und an der Substratbindung beteiligt ist. Vergleich der V-Csn-Struktur mit Strukturen der Enzyme der GH45-Familie, Endoglucanase V (Cel45) aus Humicola insolens (PDB-Code 3ENG)35,36 und der Endo-β−1,4-Glucanase (CaCel45) aus Cryptopygus antarcticus (PDB-Code 5H4U). )37 zeigt, dass die Spalte im aktiven Zentrum dieser Glykosylhydrolasen auf der einen Seite aus der DPBB-Domäne und den Schleifen besteht, die die katalytisch wichtigen Säurereste tragen, und auf der anderen Seite aus Loop-1 (einer langen mäandernden Schleife in den GH45-Enzymen). und äquivalent zur gesamten Domäne-2 in V-Csn) und Loop-3 (ein Drei-Helix-Bündel in den GH45-Enzymen) (Abb. 3e, 5h, i). Die Analyse einzelner Unterstellen im Cellohexose-Komplex von Cel45 (PDB-Code 4ENG) zeigt, dass sowohl die −1- als auch die +2-Unterstellen teilweise durch Reste von Loop1 bzw. Loop3 gebildet werden und dass diese Unterstellen, die die +1/−1-Spaltungsstelle flankieren, dies tun würden sind wichtig für die korrekte Ausrichtung des Cellulosesubstrats vor der Hydrolyse. Tatsächlich bilden sowohl in Cel45 als auch in CaCel45 die Spaltwände des aktiven Zentrums einen Tunnel, durch den das Cellulosesubstrat gefädelt wird (Abb. 5h, i).

Wie bereits erwähnt, ist eine Schleife in der V-Csn-Domäne-2 (Reste Ala90 und Thr91) an der Bildung der −2- und −3-Unterstellen beteiligt (Abb. 5g) und dürfte dieses Ende des Chitosan-Substrats korrekt ausrichten optimale Positionierung der −1/+1-Spaltungsstelle. Darüber hinaus zeigt die Überlagerung des Cellohexoase-Cel45-Komplexes mit dem Chitotriose-V-Csn-Komplex und die Modellierung der Cellohexose-Einheit in der Spalte des aktiven Zentrums von V-Csn (Abb. 6a, b), dass die Reste Asp50 und Asn54 aus Domäne-2 gebildet werden könnten +1-Unterstandort, der dieses Ende des Substrats effektiv verankert, wobei die +2- und +3-Unterstandorte höchstwahrscheinlich auf Domäne-1 beschränkt sind. Die Überlagerung der von AlphaFold vorhergesagten Modelle für die neun viralen Chitosanasen, die für die Validierung der enzymatischen Funktion ausgewählt wurden (Abb. 1), auf V-Csn zeigt, dass sie alle ein Aspartat haben, das Asp50 in V-Csn räumlich äquivalent ist, und dass vier der neun eines davon haben Asn oder Asp an einem äquivalenten Ort zu Asn54. Obwohl der zwischen Domäne-1 und Domäne-2 in V-Csn gebildete Spalt (Abb. 5e) breiter ist als der Tunnel in den GH45-Enzymen, deuten die strukturellen Ähnlichkeiten zwischen V-Csn und den GH45-Enzymen darauf hin, dass Domäne-2 eine Schlüsselrolle spielt Rolle bei der Erkennung, Bindung und optimalen Ausrichtung des Chitosan-Substrats in V-Csn.

a Molekulare Oberflächendarstellung der E157Q-V-Csn-Mutante (grüne und rosa Domänen) mit Cellohexaose (magentafarbene Stäbchen), modelliert in der Spalte des aktiven Zentrums, basierend auf der Überlagerung des Chitohexaose-Cel45-Komplexes (PDB-Code 4ENG). Die drei im E157Q-VCsn-Komplex beobachteten GlcN-Reste sind als Cyan-Stäbchen dargestellt. b Die mutmaßliche GlcN+1-Erkennungsstelle in V-Csn basierend auf der Überlagerung des Chitohexaose-Cel45-Komplexes. c Teilweises strukturbasiertes Sequenz-Alignment von V-Csn mit mehreren Enzymen, die DPBB-Domänen enthalten. Die Ausrichtung wurde aus Überlagerungen der Enzyme gegen V-Csn basierend auf ihren DPBB-Motiven bestimmt. Die vier konservierten sauren Reste, die im aktiven Zentrum von V-Csn beobachtet werden, sind blau und rot gefärbt. Passende Reste in den GH45-Enzymen und anderen DPBB-haltigen Proteinen sind ähnlich gefärbt, wenn sie strukturell äquivalent sind. Die verwendeten Sequenzen sind wie folgt: Cel45, Endoglucanase V aus Humicola isolens (Genbank P43316.1); CaCel, Endoglucanase aus Cryptopygus antarcticus (Genbank ACV50415.1); MaEG, Endoglucanase aus Melanocarpus albomyces (Genbank CAD56665.1); TtCel45A, Endoglucanase aus Thielavia terrestris (Genbank 1182607135); EXLX1, Expansin aus Bacillus subtilis (Genbank O34918); SPI, Steptomyces-Papain-Inhibitor aus Streptomyces mobaraensis (Genbank WP_004951535.1); Carwin aus Carica Papaya (Genbank 4JP6_A); Kiwellin aus Actinidia chinenesis (Genbank AGC39168.1). d Überlagerung von V-Csn (grüne und rosa Bänder, grüne und rosa Stäbchen und schwarze fettgedruckte Etiketten), Cel45 (gelbes Band, dünne gelbe Stäbchen und orangefarbene kursive Etiketten, PDB-Code 3ENG) und Expansin EXLX1 (hellblaues Band, hellblaue Stäbchen). und Cyan-Kursivschrift, PDB-Code 4FFT). Die Strukturen wurden durch Anpassen der DPBB-Motive überlagert. e Schematische Darstellung der vorgeschlagenen Spaltungsreaktion der Glykosidbindung, katalysiert durch V-Csn. Glu157 fungiert als katalytischer Protonendonor und Asp36 fungiert als katalytische Base, die ein Proton von einem Wassermolekül aufnimmt.

Wie bereits erwähnt, deuteten biochemische und enzymologische Studien an einigen bekannten GH75-Chitosanasen darauf hin, dass zwei saure Reste (entsprechend D148 und E157 in V-Csn) entscheidend an der Katalyse beteiligt sind18,19,21. Es wurde festgestellt, dass es sich bei den GH75-Enzymen um Endoglukanasen18 handelt, die die Stereochemie am anomeren Kohlenstoff umkehren und so das α-Anomer der Oligosaccharidprodukte erzeugen19,21. Daher ist es wahrscheinlich, dass V-Csn ebenfalls ein invertierendes Enzym ist. Es ist bemerkenswert, dass in DPBB-Enzymen, die als kohlenhydratbindende und/oder hydrolysierende Enzyme bezeichnet werden, der saure Rest an einer Position, die E157 in V-Csn entspricht, aufgrund der Überlagerung von V-Csn allgemein konserviert ist (entweder ein Glutamat oder ein Aspartat). mit diesen DPBBs und der anschließenden Generierung eines strukturbasierten Teilsequenz-Alignments (Abb. 6c). Strukturdaten von Cel4535,36 und CaCel4537 legen nahe, dass dieser saure Rest der katalytische Protonendonor in den GH45-Enzymen ist, und angesichts der strukturellen Ähnlichkeit der DPBB-Domänen in den GH45- und GH75-Enzymen ist es sehr wahrscheinlich, dass E157 der katalytische Protonendonor ist in V-Csn. Es ist zu beachten, dass die GH45-Enzyme als Endoglucanasen klassifiziert werden, die ebenfalls zu einer Konfigurationsumkehr am anomeren Kohlenstoff der gespaltenen glykosidischen Bindung führen43.

Die Identität der katalytischen Base ist weniger klar, obwohl Cel45 und CaCel auf der Grundlage derselben Überlagerung und Sequenzausrichtung (Abb. 6c) saure Reste in der Nähe des N-Terminus der jeweiligen Enzyme aufweisen (D10 in Cel45 und D13 in CaCel). wurden als allgemeine Base identifiziert, die das Proton während der Hydrolyse der β(1,4)-glykosidischen Bindung aufnimmt35,37. Diese Reste sind strukturell äquivalent zu D36 in V-Csn (Abb. 6d), was darauf hindeutet, dass dieser Rest auch als katalytische Base im viralen Enzym fungiert. Eine schematische Darstellung des mutmaßlichen Reaktionsmechanismus für V-Csn ist in Abb. 6e dargestellt. Wie bereits erwähnt, haben die pilzlichen und bakteriellen GH75-Enzyme an derselben Stelle einen Aspartatrest (Abb. 2b). Umgekehrt fehlt anderen DPBB-Enzymen, die vorläufig als kohlenhydratbindende und/oder hydrolytische Enzyme bezeichnet werden, ein saurer Rest, der D34 oder D36 entspricht (Abb. 6c), mit Ausnahme des Streptomyces-Papain-Inhibitorproteins (PDB-Code 5NTB)31 und Kiwellin (PDB-Code 4PMK). )26, dennoch verfügen sie über ein Aspartat, das strukturell zu D148 äquivalent ist und möglicherweise als katalytische Base in diesen Enzymen fungiert. Obwohl die Funktion jedes der vier sauren Reste im aktiven Zentrum von V-Csn noch nicht vollständig geklärt ist, deuten ihre Clusterbildung innerhalb der Spalte und die bestätigenden Beweise der Enzyme GH45 und GH75 darauf hin, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass sie eine Rolle spielen bei der Substratbindung (D34 und D148) und dem katalytischen Mechanismus (D36 und D157). Die Validierung der Funktionszuordnung muss auf weitere Mutations- und Substratbindungsstudien warten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie mehrere ökologische Implikationen hat. Wir haben mutmaßliche AMGs aus Bodenvirensequenzen identifiziert, indem wir strenge Screening-Kriterien und Inspektionen vor- und nachgelagerter kodierender Regionen angewendet haben, und konnten schlüssig nachweisen, dass zumindest einige auf Bodenviren übertragene AMGs funktionsfähig sind. Unsere strengen Analysen führten nicht nur zu einer Kristallstruktur eines bodenviralen AMG-Produkts, sondern ermöglichten uns auch, die Wirkungsweise dieses bisher nicht charakterisierten Chitosanase-Enzyms in der GH75-Familie der Glykosylhydrolasen vorzuschlagen. Die einbezogenen und verglichenen Chitosanase-Sequenzen zeigten einen phylogenetischen Unterschied zwischen viralen Chitosanasen und den zuvor in Bakterien und Pilzen beschriebenen. Da es sich bei den viralen Chitosanasen jedoch um Untergruppen innerhalb von Bakteriengruppen handelte und die mit den Chitosanase-AMGs nachgewiesenen Viren Bakteriophagen waren, deutet dies darauf hin, dass sie von Bakterien stammten. Auch die bodenviralen Chitosanasen bildeten Untergruppen, die sich von ihren Gegenstücken in aquatischen Systemen unterschieden. Das von uns funktionell und strukturell charakterisierte V-Csn-Enzym stammte aus einer Sequenz aus einem Waldboden (DOI 10.46936/10.25585/60000627, Ergänzungstabelle 1). Waldböden zeichnen sich häufig dadurch aus, dass sie mehr Pilze aufweisen als andere Bodentypen44. Dies könnte ein Grund für die Auswahl von Viren sein, die die Fähigkeit besitzen, beim Abbau von Chitin zu helfen – einem Hauptbestandteil der Zellwände von Pilzen und einer wichtigen Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff. Der Grund für die Auswahl eines Virus, der diese Fähigkeit unabhängig von seinem Wirt besitzt, ist derzeit unbekannt. In Analogie zu Meeressystemen, in denen Viren AMGs tragen, die die Energieerzeugung durch Photosynthese in ihren jeweiligen Wirten unterstützen8,9,45, können Bodenviren ihren Wirten auch dabei helfen, verfügbare Kohlenstoffressourcen im Boden abzubauen, sobald sie verfügbar werden.

Die Datenbank „Integrated Microbial Genomes and Virome (IMG/VR)“ (v3.0)46 wurde nach Sequenzen durchsucht, die den vorhergesagten Chitosanase-Genen entsprechen. Virale Contigs mit Genen, die durch ein Chitosanase-HMM (pfam07335) annotiert wurden, wurden erstmals durch Anwendung einer JGI-Viruserkennungspipeline identifiziert47. Für eine konservativere Funktionszuordnung wurden die viralen Chitosanase-Sequenzen mithilfe von hmmsearch (Hmmer v3.1b2) weiter anhand von Annotationsdatenbanken überprüft, darunter EggNOG48, der Datenbank für kohlenhydrataktive Enzyme (CAZY)49 und der Datenbank für funktionelle Ontologiezuweisungen für Metagenome (FOAM)50. 51 und Suche nach Sequenzähnlichkeiten zu NCBI-Chitosanasen mit Blastp (v2.9.0+)52. Die mutmaßlichen viralen Chitosanasen wurden dann anhand eines Profils von Lysozym-HMMs gescreent, um die falsch annotierten Lysozyme (PF13702, PF00959, PF04965, PF18013, PF00062) und ein selbst kuratiertes Lysozym HMM4 unter Verwendung der bei NCBI-Viren hinterlegten Lysozymsequenzen zu entfernen (abgerufen am 16. November). 2020).

Für eine sichere Zuordnung der Chitosanase-Gene als virale AMGs wurde der genomische Inhalt der viralen Contigs untersucht, die Chitosanase-Gene trugen und anhand der oben genannten Schritte gescreent wurden. Gene aus viralen Contigs wurden mit Prodigal (v2.6.3)53 vorhergesagt und übersetzt. Die Proteinsequenzen wurden zusätzlich zu den 7185 mikrobenspezifischen und 8773 virusspezifischen HMMs, die in checkV (v0.7.0)55 implementiert sind, durch EggNOG-Bakterien- und Archaeendatenbanken und drei Virusdatenbanken annotiert. Die Chitosanase-AMG-Kandidaten wurden entsprechend ihrer Genpositionen auf viralen Contigs und dem Vorhandensein oder Fehlen viraler Kennzeichengene4 in fünf Kategorien eingeteilt: Kategorie 0, virale Kennzeichengene (d. h. Gene, die virale Strukturproteine, Terminasen und Integrasen kodieren), sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts; Kategorie 1, virusspezifische Gene sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts sowie virale Kennzeichengene entweder stromaufwärts oder stromabwärts; Kategorie 2, virusspezifische Gene sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts, jedoch ohne virale Kennzeichengene; Kategorie 3, virusspezifische Gene entweder stromaufwärts oder stromabwärts, jedoch ohne virale Kennzeichengene; Kategorie 4, am Rande des viralen Contigs gelegen. Für nachfolgende Analysen wurden nur virale Contigs mit hohen Konfidenzwerten (Kategorien 0–2) für Chitosanase-AMGs beibehalten (Ergänzungstabelle 1).

Die viralen Contigs mit Chitosanase-AMGs wurden mit viralen RefSeq-Genomen (v201) basierend auf einer bewerteten Protein-Sharing-Matrix geclustert. Durch die Anwendung von vConTACT unter Verwendung von Standardparametern (v2.0.9.10)56 wurde ein Clustering-Netzwerk mit paarweisen Interaktionen generiert. Die Bodenvirus-Contigs teilten nicht genügend Gene mit zuvor hinterlegten Referenzviren, um eine zuverlässige taxonomische Zuordnung zu ermöglichen.

Die mutmaßlichen Wirte der viralen Contigs, die Chitosanase-AMGs trugen, wurden mithilfe von drei veröffentlichten bioinformatischen Tools vorhergesagt: 1) WIsH57 (v1.0, bester Treffer), 2) VirHostMatcher58 (v1.0.0, bester Treffer) und 3) Prokaryotischer Virus-Host Predictor (PHP)59 („Konsens“). Die endgültige Wirtstaxonomie eines viralen Contigs wurde zugewiesen, wenn die Ergebnisse von mindestens zwei der drei Tools einen Konsens erzielten.

Um die phylogenetische Verwandtschaft der nachgewiesenen viralen Chitosanasen mit GH75-Chitosanasen in anderen Taxa abzugrenzen, wurde ein phylogenetischer Baum erstellt, der auf mehreren Sequenzabgleichen von Proteinsequenzen archaeischer, bakterieller, pilzlicher und viraler Chitosanasen basiert. Der Baum wurde mit einem Bakteriophagen-Lysozym (YP_006987285.1) neu bewurzelt. Um den vielfältigen genetischen Raum über alle Lebensbereiche hinweg abzudecken, haben wir zunächst „Chitosanase“ aus der NCBI-Proteindatenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein, abgerufen am 11. Oktober 2021) und darüber hinaus abgefragt gescreent durch die GH75-Chitosanase Pfam (PF07335). Sequenzen der bakteriellen und pilzlichen GH75-Chitosanasen, die zur Identifizierung von Schlüsselresten in den aktiven Zentren verwendet wurden, wurden ebenfalls in die Referenzen aufgenommen. 18, 19. Die Referenzsequenzen wurden dann mit 70 % Aminosäureidentität geclustert, um Redundanz mithilfe von CD-HIT (v4.8.1)60 zu beseitigen, und die repräsentative Sequenz jedes Clusters mit einer Länge von mehr als 150 Aminosäuren wurde in den endgültigen Referenzsatz aufgenommen , was zu zwei Sequenzen von Archaeen, 230 von Bakterien und 180 von Pilzen führte. Die dereplizierten viralen Chitosanasen und die Referenzsequenzen wurden mithilfe von MAFFT mit Standardparametern (v7)61 abgeglichen. Die Multiple Sequence Alignments (MSAs) wurden manuell überprüft und basierend auf den Positionen der vier Schlüsselreste des vorhergesagten aktiven Zentrums in den Virus- und Referenzsequenzen angepasst. Der Bereich im Alignment reicht vom ersten konservierten Rest (vorhergesagtes aktives Zentrum) bis zum letzten konservierten Rest. Darüber hinaus behielten wir benachbarte Reste bei, die gut ausgerichtet waren, wobei <10 % der Sequenzen eine Lücke aufwiesen (Ergänzungsdaten 1). Der phylogenetische Baum wurde mit RAxML (v1.0.1) mit dem Modell LG+ G8+ F und 500 Bootstraps62 erstellt.

Das Gen, das für eine mutmaßliche bodenvirale Chitosanase-Sequenz kodiert (Ga0126380_1000012531: in Abb. 1 mit einem doppelten Sternchen gekennzeichnet), wurde chemisch synthetisiert (Twist Bioscience, San Francisco, CA) und in die NdeI-Stelle von pET28a einschließlich einer 20-Reste-Erweiterung eingefügt am N-Terminus (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH) mit einem Polyhistidin-Metallaffinitätstag (fett) und einer Thrombinprotease-Spaltungsstelle (unterstrichen) in der primären Aminosäuresequenz des exprimierten Proteins. Das rekombinante Plasmid wurde verwendet, um chemisch kompetente Escherichia coli BL21(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA) zu transformieren, woraus ∼1 ml ∼15 % Glycerinvorräte (LB-Medium, OD600 nm = ∼0,8) aus einer einzelnen Kolonie hergestellt und eingefroren wurden ( −80 °C) für die zukünftige Verwendung. Diese Glycerin-Stammlösung wurde zum Animpfen von 25 ml LB-Medium verwendet, das auf eine OD600 nm von ∼0,8 gezüchtet und dann in 750 ml Autoinduktions-LB-Medium63 (2-Liter-Kolben, 200-U/min-Schüttelgerät, 0,34 µg/µL Kanamycin, 37 °C) überführt wurde. . Bei Erreichen einer OD600nm von etwa 1 wurde die Temperatur auf 30 °C gesenkt. Die Zellen wurden etwa 16 Stunden später (am nächsten Tag) durch sanfte Zentrifugation geerntet und dann eingefroren (–80 ° C). Die Zellen wurden durch Auftauen des gefrorenen Pellets und anschließende Ultraschallbehandlung (ca. 1 Minute) vor und nach drei Durchgängen durch eine French Press (SLM Aminco, Rochester, NY) lysiert. Nach der Zentrifugation wurde das Protein in der löslichen Fraktion unter Verwendung eines herkömmlichen zweistufigen Reinigungsprotokolls gereinigt: Metallchelat-Affinitätschromatographie auf einer 20 ml Ni-Agarose 6 FastFlow-Säule (GE Healthcare, Piscataway, NJ), gefolgt von Gelfiltrationschromatographie auf a Superdex HiLoad 26/60-Säule (GE Healthcare, Piscataway, NJ)64. Fraktionen, die nach dem letzten Säulenschritt das Zielprotein enthielten, wurden auf 2–5 mg/ml konzentriert (Proteinpuffer: 100 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM DTT, pH 7) und bei 4 °C gelagert, bis sie zur Kristallisation oder für Enzyme verwendet wurden Untersuchungen. Pro Liter LB-Medium wurden Ausbeuten von 2–4 mg gereinigtem Protein erhalten. Das gleiche Protokoll wurde angewendet, um zwei modifizierte Proteine ​​herzustellen, die jeweils die Punktsubstitution D148N oder E157Q enthielten. Die Mutagenese wurde wie folgt durchgeführt65: Kurz gesagt, der erste Strang des Template-Plasmids, das das Wildtyp-Gen enthielt, wurde mit Nt.BbvCI geschnitten und mit Exonuklease I und III verdaut. Oligonukleotide (Thermo Fisher, Pleasanton, CA) wurden entwickelt, um Punktmutationen an gewünschten Stellen einzuführen, und wurden im Verhältnis 1:20 mit der einzelsträngigen Matrizen-DNA hinzugefügt. Die Priming-Sequenzen wurden mit Phusion-Polymerase verlängert. Nach der Auflösung der Nicks mit Taq-DNA-Ligase wurde der zweite Wildtyp-Strang mit Nb.BbvCI geschnitten, mit Exonuklease I verdaut und durch Priming aus einem zweiten Oligonukleotid regeneriert, um ein vollständiges mutagenisiertes dsDNA-Molekül zu erzeugen. Alle Enzyme wurden von NEB, Ipswich, MA bezogen. Zusammengesetzte Konstrukte wurden sequenzverifiziert (Pacific Biosciences Sequel IIe, PacBio, Menlo Park, CA).

Wildtyp-V-Csn und die beiden modifizierten Proteine ​​wurden auf Endo-Chitosanase-Aktivität unter Verwendung eines mit Azurin vernetzten (AZCL) Chitosansubstrats (AZCL-Chitosan; Megazyme, Wicklow, Irland) getestet66. Stammlösungen (1200 μg/ml) jedes Proteins wurden in Proteinpuffer zusammen mit AZCL-Chitosan-Suspensionen (2500 μg/ml) bei pH 4,3, 5,1 und 6,5 in 40 mM Natriumacetat, 100 mM NaCl, 1 mM DTT hergestellt. Die Reaktionen wurden dreifach bei Raumtemperatur durchgeführt, indem 17 μL Protein (20 μg) zu 100 μL AZCL-Chitosan in einem 500 μL Eppendorf-Röhrchen gegeben wurden. Die Röhrchen wurden durch Rotation (40 U/min) in einem Multi-Purpose Tube Rotator (Fisher Scientific) bewegt. Die Aktivität wurde durch Pelletieren des Substrats mit kurzer Zentrifugation und Messen der Absorption des freigesetzten azuringebundenen Produkts bei 590 nm (NanoDrop 2000c; Thermo Scientific) unter Verwendung eines 2-μl-Aliquots überwacht. Blindreaktionen zeigten in Abwesenheit von Proteinen keine Freisetzung von Azurin-verknüpftem Produkt und pH-Messungen vor und nach der Reaktion schwankten um weniger als 0,1 pH-Einheiten.

Die anfänglichen Kristallisationsbedingungen für V-Csn wurden mit der Methode des hängenden Tropfens unter Verwendung des Top96-Siebes (Anatrace) ermittelt. Kristalle wurden unter verschiedenen Bedingungen beobachtet. Kristalle aus verschiedenen Bedingungen wurden geerntet und in flüssigem Stickstoff unter ihren jeweiligen Kristallisationsbedingungen, angereichert mit 20 % Ethylenglykol, blitzgekühlt. Die Kristalle wurden zur Beugungsuntersuchung an der Strahllinie BL9-2 an SSRL geschickt. Drei Bedingungen ergaben Kristalle, die mit hoher Auflösung beugten; Bedingung Nr. 45 (0,2 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Natriumacetat pH 4,6, 30 % MMePEG2000) in Raumgruppe C2 mit Elementarzellenabmessungen a = 108,84 Å, b = 47,63 Å, c = 45,55 Å, β = 97,8°, mit einer Monomer in der asymmetrischen Einheit (AU); Bedingung #38 (0,1 M Citrat pH 5,5, 20 % PEG3000) in Raumgruppe C2 mit Elementarzellenabmessungen a = 163,30 Å, b = 46,00 Å, c = 73,56 Å, β = 92,3°, mit zwei Monomeren in der AU; und Bedingung Nr. 20 (0,2 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Bistris pH 5,5, 25 % PEG3350) in der Raumgruppe C2 mit Elementarzellenabmessungen a = 80,47 Å, b = 35,76 Å, c = 80,66 Å, β = 118,5°, mit einem Monomer in der AU.

Datensätze wurden von Einkristallen unter den Bedingungen Nr. 45 und Nr. 38 gesammelt. Für den Zustand #45-Kristall (bezeichnet als apo1) wurden 1800 0,2°-Bilder auf BL12-2 unter Verwendung von Röntgenstrahlen bei 17000 eV (0,72929 Å) und einem Pilatus 6 M PAD-Detektor im Shutterless-Modus aufgenommen. Die Bilder wurden mit XDS (v. 5. Februar 2021)67 verarbeitet und mit AIMLESS68 skaliert. Der endgültige Datensatz umfasste 174574 einzigartige Reflexionen mit einer Auflösung von 0,89 Å. Für den Zustand #38-Kristall (Apo2) wurden 1800 0,2°-Bilder auf BL9-2 mit Röntgenstrahlen bei 12658 eV (0,97946 Å) und einem Pilatus 6 M PAD-Detektor im Shutterless-Modus aufgenommen. Die Bilder wurden mit XDS67 verarbeitet und mit AIMLESS68 skaliert, und der endgültige Datensatz umfasste 117982 einzigartige Reflexionen mit einer Auflösung von 1,35 Å. Zusätzliche Datenerfassungs- und Verarbeitungsstatistiken für beide Kristallformen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Zur experimentellen Phaseneinteilung wurde eine KBr-Einweichlösung hergestellt, indem festes KBr in Kristallisationspuffer der Bedingung Nr. 45, angereichert mit 25 % Glycerin, gelöst wurde, bis eine gesättigte Lösung erhalten wurde (wie visuell unter einem Mikroskop bestimmt). Diese Lösung wurde mit frischem Puffer verdünnt, um eine 1/8 gesättigte Kristalleinweichlösung zu bilden. Mehrere Apo1-Kristalle wurden schnell in dieser Lösung geschwenkt und in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt. Beugungsdatensätze wurden von KBr-getränkten Apo1-Kristallen an der Strahllinie BL12-2 am Bromidrand (13.481 eV, 0,91967 Å) gesammelt. Insgesamt wurden 3600 Bilder mit einem Rotationswinkel von 0,2°/Bild, unter Verwendung der Inverse-Beam-Methode und 20°-Keilen aufgenommen. Die Bilder wurden mit XDS67 verarbeitet und mit AIMLESS (v0.7.7)68 skaliert. Weitere Statistiken sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die erste Analyse der Daten zeigte ein starkes anomales Signal des Bromids mit einer Auflösung von etwa 1,7 Å.

Die V-Csn-Struktur wurde durch in PHENIX22 implementierte Br-SAD-Methoden (Bromide Single Anomalous Diffraction) gelöst. Nach der Abflachung des Lösungsmittels und der Änderung der Dichte betrug der Gesamtwert (FOM) 0,363 für 16 Bromidstellen. Autobuilding in PHENIX (v1.20.1-4487) generierte ein Modell, das 221 von 224 erwarteten Resten umfasste. Die anfängliche Verfeinerung mit phenix.refine24 ergab einen Rwork und Rfree von 0,158 bzw. 0,187. Das Modell wurde mit COOT23 vervollständigt und mit phenix.refine unter Verwendung der apo1-Daten auf eine Auflösung von 0,89 Å weiter verfeinert. An strukturell und chemisch relevanten Positionen wurden Wassermoleküle hinzugefügt und die atomaren Verschiebungsparameter für alle Atome in der Struktur isotrop verfeinert. Die Apo2-Struktur wurde durch molekularen Ersatz mit dem Programm MOLREP (v11.9.02)69 aus der CCP4-Suite70 gelöst, wobei die verfeinerte Apo1-Struktur als Suchmodell verwendet wurde. Die endgültigen Verfeinerungsstatistiken für die beiden Apo-V-Csn-Strukturen sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Die V-Csn-Mutanten D148N und E157Q wurden unter Verwendung der Bedingungen Nr. 20, Nr. 38 und Nr. 45 auf Kristallisation untersucht, und in allen drei Fällen wurden Kristalle beobachtet. Beugungsdatensätze wurden von einzelnen D148N- und E157Q-Kristallen aus Bedingung Nr. 45 gesammelt. Für die D148N-Kristalle wurden 1800 Bilder (0,2° Drehung/Bild) auf BL12-2 gesammelt und die Daten mit XDS67 und AIMLESS68 verarbeitet und skaliert. Für den E157Q-Kristall wurden 1850 Bilder auf BL12-2 gesammelt und die Daten mit XDS67 und AIMLESS68 verarbeitet und skaliert. Statistiken zur Datenerfassung sind in Tabelle 3 aufgeführt. Beide Strukturen wurden durch molekularen Ersatz mit MOLREP69 unter Verwendung der verfeinerten Wildtyp-V-Csn-Struktur als Ausgangsmodell gelöst, wobei alle Wassermoleküle entfernt wurden. Die D148N- und E157Q-Strukturen wurden mit phenix.refine24 verfeinert, und die endgültigen Statistiken sind auch in Tabelle 3 aufgeführt.

Der E157Q-Substrat-Komplex wurde durch Auflösen von 0,06 mg Chitohexaose (Biosynth) in 10 µL E157Q mit 3,3 mg/ml hergestellt, was eine endgültige Chitohexaose-Konzentration von etwa 5 mM ergab. Der Komplex wurde 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert, bevor er gegen die Kristallisationsbedingung Nr. 45 getropft wurde. Die Kristallisationstropfen wurden mehrere Stunden nach dem Aufbau mit einer Streifenbeimpfung versehen und über Nacht wurden in allen Tropfen Kristalle des Komplexes beobachtet. Die Kristalle waren morphologisch den unter den gleichen Bedingungen gezüchteten Wildtyp- und Mutantenkristallen ähnlich. Die Kristalle wurden in Kristallisationspuffer, angereichert mit 25 % Glycerin, überführt und in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt. Beugungsdaten wurden bei BL12-2 gesammelt. Insgesamt wurden 1800 Bilder gesammelt und die Daten mit XDS67 und AIMLESS68 verarbeitet und skaliert. Die Struktur des E157Q-Substrat-Komplexes wurde durch molekularen Ersatz mit MOLREP69 unter Verwendung der verfeinerten Wildtyp-V-Csn-Struktur, bei der alle Wassermoleküle entfernt wurden, als Ausgangsmodell gelöst und mit phenix.refine24 verfeinert. Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Die AlphaFold-Strukturvorhersagen wurden entweder mit einer lokal installierten Version der aus dem offiziellen GitHub-Repository (https://github.com/deepmind/alphafold) abgerufenen Software oder mit dem kollaborativen AlphaFold-Notizbuch von Google (https://colab.research) ausgeführt. google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb). Für Lösungsmittel zugängliche Oberflächen wurden mit PyMOL (v2.5.2) (Schrödinger) und ICM-Pro (v3.8-6a) (Molsoft) unter Verwendung eines Sondenradius von 1,4 Å (entspricht dem Radius eines einzelnen Wassermoleküls) berechnet. Die elektrostatischen Oberflächen wurden mit dem Adaptive Poisson-Boltzmann Solver (APBS) Plugin für PyMOL (v2.5.2) generiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die für Abb. 1 verwendeten Virussequenzdaten sind auf der JGI-Website [https://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/vr/main.cgi] ohne Nutzungsbeschränkung gemäß der JGI-Datenrichtlinie öffentlich verfügbar. Die Atomkoordinaten und Strukturfaktoren für die Proteinstrukturen wurden an die RSCB Protein Data Bank (PDB) unter den Zugangscodes 7TVL (V-Csn apo1), 7TVM (V-Csn apo2), 7TVN (V-Csn-D148N) übermittelt. 7TVO (V-Csn-E157Q) und 7TVP (V-Csn-E157Q-Chitohexaose-Komplex). Die den Abb. 2a, c zugrunde liegenden Quelldaten werden als Quelldatendateien bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde vom Office of Biological and Environmental Research (BER) des Energieministeriums (DOE) unterstützt und ist ein Beitrag des wissenschaftlichen Schwerpunktbereichs „Phänotypische Reaktion des Bodenmikrobioms auf Umweltstörungen“ an JKJ und KSH. Ein Teil dieser Arbeit wurde im Rahmen einer Projektvergabe (https://doi.org/10.46936/cpcy.proj.2021.60161/60000437) im Rahmen des FICUS-Programms an JEM durchgeführt und nutzte Ressourcen am DOE Joint Genome Institute (JGI) und dem Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL), bei dem es sich um Benutzereinrichtungen des DOE Office of Science handelt. Beide Einrichtungen werden vom Programm „Biologische und Umweltforschung“ gefördert und unter den Vertragsnummern DE-AC02-05CH11231 (JGI) und DE-AC05-76RL01830 (EMSL) betrieben. Die Kristallstrukturen wurden an der Stanford Synchrotron Radiation Lightsource (SSRL) bestimmt. SSRL ist eine nationale Benutzereinrichtung, die von der Stanford University im Auftrag des US-Energieministeriums, Office of Basic Energy Sciences, unter der Vertragsnummer DE-AC02-76SF00515 betrieben wird. Das SSRL-Programm für strukturelle Molekularbiologie wird vom Energieministerium, dem Amt für biologische und Umweltforschung und den National Institutes of Health (NIGMS) mit der Fördernummer P30GM133894 unterstützt. Vorläufige Ergebnisse zur enzymatischen Funktion wurden von Gregor Tegl und Stephen Withers von der University of British Columbia bereitgestellt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ruonan Wu, Clyde A. Smith.

Direktion für Erd- und Biowissenschaften, Pacific Northwest National Laboratory, Richland, WA, USA

Ruonan Wu, Garry W. Buchko, Jason E. McDermott, Kirsten S. Hofmockel, John R. Cort und Janet K. Jansson

Stanford Synchrotron Radiation Light Source, Stanford University, Menlo Park, CA, USA

Clyde A. Smith

Fakultät für Molekulare Biowissenschaften, Washington State University, Pullman, WA, USA

Garry W. Buchko

Joint Genome Institute des US-Energieministeriums, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA

Ian K. Blaby, Nikos C. Kyrpides und Yasuo Yoshikuni

Mammoth Biosciences, Brisbane, CA, USA

David Paez-Espino

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie, Oregon Health & Science University, Portland, OR, USA

Jason E. McDermott

Institut für biologische Chemie, Washington State University, Pullman, WA, USA

John R. Cort

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RW führte den Großteil der bioinformatischen Analysen durch. CAS bestimmte die Kristallstrukturen der Chitosanase-Enzyme und klärte ihre Mechanismen auf. GWB exprimierte die Chitosanase-Proteine, überprüfte die Kristallisationsbedingungen und führte Aktivitätstests durch. IKB und YY führten die Synthese und Klonierung von Chitosanase-Genen und -Mutanten durch. NCK stellte den Datenbankabruf und die DOIs öffentlich verfügbarer Chitosanase-Sequenzen bereit. DP-E., JRC und CAS führten die AlphaFold-Vorhersagen der Proteinstruktur durch. KSH, JKJ, JEM und CAS finanzierten die Forschung. JKJ koordinierte die Studie. Alle Autoren haben zum Verfassen des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Janet K. Jansson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Rey-Ting Guo und Ella Sieradzki für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Wu, R., Smith, CA, Buchko, GW et al. Strukturelle Charakterisierung eines bodenviralen Hilfsstoffwechselgenprodukts – einer funktionellen Chitosanase. Nat Commun 13, 5485 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32993-8

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Eingegangen: 30. März 2022

Angenommen: 26. August 2022

Veröffentlicht: 19. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32993-8

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Nature Reviews Mikrobiologie (2023)

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